|
|
|
Зоров Иван Никитич Задача 7. Выделение ферментов, определение биохимических и каталитических свойств. Вопросы для подготовки к задаче. Теоретическая часть. Источники ферментов и их специфика. Принципы выбора источника для выделения требуемого фермента. Внутриклеточные, мембранные и секретируемые ферменты. Гомогенизация биоматериала: приемы и оборудование. Приготовление грубых экстрактов. Основные лабораторные приемы, используемые при очистке ферментов. Фильтрование, центрифугирование, диализ, гель- и ультрафильтрация, лиофилизация. Аналитические методы, используемые при определении концентрации белков в растворе. Разделение белков путем осаждения. Изоэлектрическое осаждение, высаливание, осаждение органическими растворителями. Денатурация балластных белков под действием температуры, органических растворителей и путем изменения рН. Хроматография. Основные принципы и элементы теории элюции. Матрицы для хроматографии. Виды хроматографической элюции. Матрицы для хроматографии. Хроматография высокого давления. Методы детектирования. Ионообменная хроматография. Основные принципы. Сильные и слабые ионообменники. Факторы среды и свойства белков, влияющие на эффективность разделения. Изократическая и градиентная элюция. Гель-проникающая (эксклюзионная) хроматография. Разделение макромолекул и обессоливание белков. Требования к проведению хроматографического процесса. Факторы, мешающие проведению качественного разделения. Определение параметров колонки. Определение молекулярной массы белков. Гидрофобная хроматография. Основные принципы. Свойства функциональных групп носителей для гидрофобной хроматографии. Влияние температуры и значения рН на гидрофобные взаимодействия. Ослабление гидрофобных взаимодействий и элюирование. Аффинная хроматография. Основные принципы. Эффективность очистки. Групповая аффинность. Электрофоретические методы. Препаративный и аналитический электрофорез. Нативный электрофорез и электрофорез в присутствии детергентов. Определение степени гомогенности и молекулярной массы. Изоэлектрофокусирование. Основные принципы и области применения. Изотахофорез. Методы седиментационного анализа. Скоростная и равновесная седиментация. Коэффициент седиментации, уравнение Сведберга. Практическая часть Очистка и выделение ферментов при помощи высокоэффективной белковой хроматографии и проведения белкового электрофореза в денатурирующих условиях. Хроматографическая система среднего давления Pharmacia FPLC. Знакомство с устройством и принципами работы. Основные блоки - насосы, узел ввода образца (инжектор), хроматографические колонки, детектор, коллектор фракций, система управления и программирования. Основы управления хроматографической системой, ручной и автоматический режим, система команд, создание методов. Подготовка хроматографической системы к работе. Приготовление элюентов, подготовка хроматографических колонок к работе. Выбор буферных растворов, буфер для нанесения образца, выбор элюирующего буфера. Подготовка и нанесение образца, элюирование связавшихся белков, сбор фракций. Регенерация колонки и консервация системы по окончании работы. Проведение электрофореза белков в присутствии додецилсульфата натрия (электрофорез в денатурирующих условиях). Знакомство с оборудованием. Приготовление и заливка гелей. Подготовка образцов для электрофореза, осаждение и концентрирование. Проведение электрофореза, фиксация и окрашивание белковых полос. Отмывка и хранение. Построение градуировочного графика с использованием белков-маркеров. Расчет молекулярной массы определяемых белков. Измерение ферментативных активностей. Подбор разбавлений растворов ферментов. Определение фона фермента и субстрата. Расчет активности ферментов. Задача 7а. Масс-спектрометрические методы изучения белков. Вопросы для подготовки к задаче. Теоретическая часть. Введение в масс-спектрометрию биомолекул, основные понятия (молекулярный ион, базовый пик, относительная интенсивность, разрешение). Составные части масс-спектрометра. Источники ввода и ионизации образца, границы применения. Электронная и химическая ионизация, основные принципы. Электроспрей. МALDI, основные принципы, типы матриц. Масс-анализаторы: квадруполь, ионная ловушка, времяпролетный, ячейка ион-циклотронного резонанса. Разрешение и диапазон m/z. Тандемные / гибридные системы. Варианты сопряжения источника ионов и масс-анализатора. Протеомные исследования. Разделение белков хроматографическими и электрокинетическими методами. Специфичность протеаз, получение пептидов. Идентификация белка по пептидному отпечатку. Принципы дефрагментации пептидов. Установление первичной последовательности по масс-спектрометрическим данным. Литература
Дополнительная литература
|
Общая информация |
Научные подразделения |
Учебный процесс |
История кафедры
Полезные ссылки |
Новости |
О сервере
© 1998-2003 Кафедра Химической Энзимологии, Химический Факультет
Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова