Задача 7. Выделение ферментов, определение биохимических и каталитических свойств.

Вопросы для подготовки к задаче. Теоретическая часть.

Источники ферментов и их специфика. Принципы выбора источника для выделения требуемого фермента. Внутриклеточные, мембранные и секретируемые ферменты.

Гомогенизация биоматериала: приемы и оборудование. Приготовление грубых экстрактов.

Основные лабораторные приемы, используемые при очистке ферментов. Фильтрование, центрифугирование, диализ, гель- и ультрафильтрация, лиофилизация. Аналитические методы, используемые при определении концентрации белков в растворе.

Разделение белков путем осаждения. Изоэлектрическое осаждение, высаливание, осаждение органическими растворителями. Денатурация балластных белков под действием температуры, органических растворителей и путем изменения рН.

Хроматография. Основные принципы и элементы теории элюции. Матрицы для хроматографии. Виды хроматографической элюции. Матрицы для хроматографии. Хроматография высокого давления. Методы детектирования.

Ионообменная хроматография. Основные принципы. Сильные и слабые ионообменники. Факторы среды и свойства белков, влияющие на эффективность разделения. Изократическая и градиентная элюция.

Гель-проникающая (эксклюзионная) хроматография. Разделение макромолекул и обессоливание белков. Требования к проведению хроматографического процесса. Факторы, мешающие проведению качественного разделения. Определение параметров колонки. Определение молекулярной массы белков.

Гидрофобная хроматография. Основные принципы. Свойства функциональных групп носителей для гидрофобной хроматографии. Влияние температуры и значения рН на гидрофобные взаимодействия. Ослабление гидрофобных взаимодействий и элюирование.

Аффинная хроматография. Основные принципы. Эффективность очистки. Групповая аффинность.

Электрофоретические методы. Препаративный и аналитический электрофорез. Нативный электрофорез и электрофорез в присутствии детергентов. Определение степени гомогенности и молекулярной массы. Изоэлектрофокусирование. Основные принципы и области применения. Изотахофорез.

Методы седиментационного анализа. Скоростная и равновесная седиментация. Коэффициент седиментации, уравнение Сведберга.

Практическая часть
(Загрузить методическую разработку)

Очистка и выделение ферментов при помощи высокоэффективной белковой хроматографии и проведения белкового электрофореза в денатурирующих условиях.

Хроматографическая система среднего давления Pharmacia FPLC. Знакомство с устройством и принципами работы. Основные блоки - насосы, узел ввода образца (инжектор), хроматографические колонки, детектор, коллектор фракций, система управления и программирования. Основы управления хроматографической системой, ручной и автоматический режим, система команд, создание методов.

Подготовка хроматографической системы к работе. Приготовление элюентов, подготовка хроматографических колонок к работе.

Выбор буферных растворов, буфер для нанесения образца, выбор элюирующего буфера. Подготовка и нанесение образца, элюирование связавшихся белков, сбор фракций. Регенерация колонки и консервация системы по окончании работы.

Проведение электрофореза белков в присутствии додецилсульфата натрия (электрофорез в денатурирующих условиях). Знакомство с оборудованием. Приготовление и заливка гелей. Подготовка образцов для электрофореза, осаждение и концентрирование. Проведение электрофореза, фиксация и окрашивание белковых полос. Отмывка и хранение. Построение градуировочного графика с использованием белков-маркеров. Расчет молекулярной массы определяемых белков.

Измерение ферментативных активностей. Подбор разбавлений растворов ферментов. Определение фона фермента и субстрата. Расчет активности ферментов.

Задача 7а. Масс-спектрометрические методы изучения белков.

Вопросы для подготовки к задаче. Теоретическая часть.

Введение в масс-спектрометрию биомолекул, основные понятия (молекулярный ион, базовый пик, относительная интенсивность, разрешение).

Составные части масс-спектрометра. Источники ввода и ионизации образца, границы применения. Электронная и химическая ионизация, основные принципы. Электроспрей. МALDI, основные принципы, типы матриц. Масс-анализаторы: квадруполь, ионная ловушка, времяпролетный, ячейка ион-циклотронного резонанса. Разрешение и диапазон m/z. Тандемные / гибридные системы. Варианты сопряжения источника ионов и масс-анализатора.

Протеомные исследования. Разделение белков хроматографическими и электрокинетическими методами. Специфичность протеаз, получение пептидов. Идентификация белка по пептидному отпечатку.

Принципы дефрагментации пептидов. Установление первичной последовательности по масс-спектрометрическим данным.

Литература

1. Л.А. Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М., Наука, 1985
2. Л.А. Остерман. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М., Наука, 1981.
3. Р. Скоупс. Методы очистки белков. М., Мир, 1985.
4. A Guide to Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Detection. Bulletin 6040 Rev A. Bio-Rad Laboratories, Inc., 05/2012.
5. Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography. Principles and Methods. GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden, 02/2006.
6. Ion Exchange Chromatography & Chromatofocusing. Principles and Methods. GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden, 04/2010
7. Принципы масс спектрометрии в приложении к биомолекулам. Под ред. Дж. Ласкин, Х. Лифшиц. М:, Техносфера, 2012
8. А.Т. Лебедев. Масс-спектрометрия в органической химии. М., БИНОМ, 2003.

Дополнительная литература

1. Biopharmaceutical Characterization. MALDI-TOF/TOF-MS. Bruker Daltonik GmbH. #701433, 05/2012.
2. MALDI Imaging - Mass Spectrometric Imaging. Bruker Daltonik GmbH. BDAL, #1821823, 07/2013.
3. MALDI Biotyper. Poster Hall 2012. Bruker Daltonik GmbH. BDAL #1818090, 04/2013
4. Precise MW Determination of Intact Proteins by Multiple Charge State Analysis of MALDI Generated Ions. Application Note # MT-112., Bruker Daltonics 05/2012.