Вопросы к зачетам и экзаменам по спецкурсам, читаемым на кафедре химической энзимологии

 

 

 

 

"ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКОВ, МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ."

 Профессор Гладилин А.К., 3 курс, 6й семестр

 

1. ПРИНЦИПЫ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВ.

 Основные стадии биосинтеза белка. ДНК-РНК-белок. Генетический код. Свойства боковых радикалов аминокислот. Пептидная связь, ее энергетика и геометрия. Цис-транс изомерия аминокислотных остатков. Типы невалентных взаимодействий и их роль в поддержании пространственной структуры белков. Дисперсионные и электростатические взаимодействия, водородная связь. Гидрофобные взаимодействия. Изменения в системе ковалентных связей белка, возникающие в результате фолдинга и процессинга. Дисульфидные мостики, N- и С-концевые модификации, ферментативное удаление сигнальных последовательностей. Иерархия уровней структурной организации белков. Первичные, вторичные, сверхвторичные структуры. Функциональные и структурные домены, глобулярные и олигомерные белки.

2. ЗАКОНОМЕРНОСТИ СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКОВ.

Способы слежения за различными конформациями белка. Термодинамика конформаций белка. Самопроизвольный характер сворачивания.

Кинетика стадий сворачивания. Быстрые и медленные стадии. Цис-транс

изомеризация остатков пролина. Пептидил пролил цис-транс изомераза.

Образование системы правильных S-S связей. Протеин дисульфид изомераза.

Сворачивание олигомерных белков. Влияние лигандов на процесс сворачивания. Сворачивание белков in vivo. Основные закономерности. Белки-шапероны.

 

3. СТАБИЛЬНОСТЬ БЕЛКОВ.

Стабильность белков in vivo и ее связь со структурой. Время жизни и пути деградации белков в клетках. Термодинамическая стабильность и ее связь со структурой.

Экспериментальные подходы к изучению связи структура-стабильность.

Реакционноспособные группы в структуре белков. Молекулярные причины термодинамической стабильности.

Операционная стабильность. Обратимая денатурация. Механизмы необратимой инактивации.

етоды получения стабильных биокатализаторов. Мезо- и термофильные источники высокостабильных ферментов. Приемы иммобилизации и химической модификации белков.

4. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Источники белков и их специфика. Принципы выбора источника для выделения требуемого белка. Внутриклеточные, мембранные и секретируемые ферменты.

Гомогенизация биоматериала: приемы и оборудование. Приготовление грубых экстрактов.

 

5. ОЧИСТКА БЕЛКОВ.

Лабораторные приемы, используемые при очистке белков. Фильтрование,

центрифугирование, диализ, гель- и ультрафильтрация.

Разделение белков путем осаждения. Изоэлектрическое осаждение, высаливание, осаждение органическими растворителями. Денатурация балластных белков под действием температуры, органических растворителей и путем изменения рН.

Хроматография. Основные принципы и элементы теории хроматографической элюции. Матрицы для хроматографии. Виды хроматографии. Хроматография высокого давления. Гель-фильтрация. Разделение макромолекул и обессоливание белков.

Определение параметров колонки и хроматографического процесса.

Определение молекулярной массы белков.

Ионообменная хроматография. Анионо- и катионообменная хроматография.

Сильные и слабые ионообменники. Факторы среды и свойства белков,

влияющие на эффективность разделения. Изократическая и градиентная

элюция.

Аффинная хроматография. Основные принципы. Эффективность очистки.

Групповая аффинность. Электрофоретические методы. Препаративный и аналитический электрофорез. Нативный электрофорез и электрофорез в присутствии детергентов. Определение степени гомогенности и молекулярной массы белков. Изоэлектрофокусирование. Основной принцип и области применения.

 

 

 

ОСНОВЫ БИОХИМИИ

Профессор Гладилин А.К., 4 курс, 7й семестр, 2004/2005 уч. год

 

 

 

"МЕХАНИЗМЫ ХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ В РАСТВОРАХ"

Доцент Казанков Г.М., 4 курс 7й семестр

1. Элементарная химическая стадия и механизм химической реакции. Стехиометрический и тонкий механизмы. Скорость химической реакции и закон действия масс. Кинетический порядок и молекулярность реакции;

сущность их принципиального отличия. Теория переходного состояния (активировнного комплекса). Переходное состояние это уже не исходное соединение, но еще не конечный продукт. Определение строения переходного состояния. Диффузия и теория столкновений. Уравнение Аррениуса.

2. Кинетика некоторых простых реакций. Необратимые мономолекулярные реакции. Вычисления констант скорости. Случай спектрофотометрического контроля. Обратимые мономолекулярные реакции. Концепция "псевдомоно- молекулярности" и условия ее применения. Последовательные мономолекулярные реакции. Понятие о скоростьлимитирующей стадии. Параллельные мономолекулярные реакции. Бимолекулярные реакции: простейший случай.

3. От простых реакций к более сложным кинетическим схемам. Принцип стационарных концентраций Боденштейна. Уравнение Михаэлиса-Ментен и его многочисленные аналоги. Влияние ионов водорода и разнообразных лигандов на скорости химических реакций. рН профили. Реакции нулевого и псевдонулевого порядка. Автокаталитические реакции. Понятие о колебательных реакциях (на примере реакции Белоусова-Жаботинского).

4. Основные инструменты химической кинетики. Кинетические изотопные эффекты (первичные и вторичные). Понятие о туннелировании протона. Изотопные эффекты растворителей. Линейные соотношения свободных энергий. Корреляционные уравнения Гаммета и Тафта. Уравнение Бренстеда. Сольватационные эффекты и влияние растворителей на скорости химических реакций. Эмпирические подходы и проблема разделения эффектов сольватации основного и переходного состояний. Активационые параметры и механизмы химических реакций. Энтальпия и энтропия активации как критерии природы скоростьлимитирующей стадии. Активационный объем как указатель диссоциативного или ассоциативного механизма химической реакции.

5. Катализ. Специфический кислотный катализ. Специфический основный катализ. Общий кислотно-основной и нуклеофильный катализ. Электрофильный катализ. Катализ сближением.

6. Перенос электрона. Внутри- и внешнесферный перенос. Теория внешнесферного переноса электрона Маркуса. Кросс-уравнение Маркуса. Понятие об инверсионной области.

 

 

<МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ. 2005 г.>

Доцент Н.Г.Белогурова, профессор В.И.Тишков, 4 курс, 8й семестр

 

1. Структура и функции нуклеиновых кислот. ДНК. РНК. Строение двойной спирали. B, A и Z формы ДНК.

2. Геном. Особенности организации генома про- и эукариот. Хромосомы. Внехромосомная ДНК. Плазмиды. Теломерная ДНК и теломераза.

3. Репликация ДНК. Инициация. Механизм полуконсервативной репликации. Ферментативный аппарат репликации ДНК.

4. ДНК-полимераза I и III E.coli. Понятие праймера. Фрагменты Оказаки.

5. Топология репликации ДНК. Геликазы. Топоизомеразы I и II типа. Суперспирализация ДНК. Релаксация супервитков ДНК.

6. Регуляция инициации репликации у про- и эукариот. Особенности репликационного комплекса эукариот.

7. Механизм репликации по типу катящегося кольца (Rolling circle). Другие механизмы репликации.

8. Механизмы, обеспечивающие точность репликации ДНК. 3'-5'экзонуклеазная активность ДНК-полимераз. Система коррекции ДНК.

9. Понятие гена. Открытая рамка считывания. Генетический код и его особенности. Последовательность Шайна-Дальгарно.

10. Особенности  строения генов эукариот. Экзоны и интроны. Сплайсинг мРНК.

11. Генетические процессы транспорта ДНК между клетками. Трансмиссия (конъюгация), трансдукция и трансформация. Системы рестрикции и модификации ДНК. Специфическое метилирование ДНК. ДНК метилазы и их биологическое значение.

12. Рекомбинация ДНК. Гомологичная, сайт-специфическая, транспозиция. Жизненный цикл фага лямбда.

13. Транскрипция мРНК. РНК-полимераза E.coli. Промоторы и терминаторы транскрипции.

14. Контроль экспрессии генов прокариот. Понятие оперона на примере организации лактозного оперона. Позитивная и негативная регуляция. Репрессоры и активаторы транскрипции.

15. 0собенности регуляции экспрессии генов у эукариот. РНК-полимеразы I, II и III. Структура мРНК. Сплайсинг мРНК. Образование "кэп"-структуры и полиаденилированных 3'-концов. Особенности строения эукариотических промоторов. Значение транскрипционных активаторов для экспрессии генов.

16. Генетическое понятие мутации. Химическая природа мутаций. Репарация ДНК (до-и пострепликационная).

17. Основные этапы биосинтеза белка.

18. Транспортная РНК - трансляционный посредник. Строение, реакции с участием т-РНК.

19. Структура и функция рибосомы. Особенности рибосом про- и эукариот.

20. Этапы активации аминокислот и инициации синтеза белка.

21. Этапы элонгации и терминации синтеза белка.

22. Генетический код и его особенности.

23. Генетическая инженерия бактерий. Понятие вектора. Клонирование ДНК. Ферменты, используемые в генной инженерии.

 

 

<ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КА><ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КА>ТАЛИЗА>

 

Доцент Г.М.Казанков, 5 курс, 9й семестр

 

Белки как биокатализаторы. Типы гомогенного катализа: сближение и ориентация, кислотно-основной, электрофильный и нуклеофильный. Сравнение ферментов с органическими катализаторами гомогенного типа (эффективность действия, специфичность и стереоспецифичность, регуляторные свойства ферментов). Аминокислоты, их кислотно-основные свойства, полярность, гидрофобность и гидрофильность (параметр Ганша).

Механизм сорбции молекул и ионов на активном центре. Водородная связь, электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия, комплексы с переносом заряда и оценка их вклада в сорбцию субстрата на ферменте. Коиформациоииыс изменения в структуре белка и лиганда, сопровождающие сорбцию. Оценка свободной энергии сорбции (экстракционная и экстракционно-конформационная модели).

Свободная энергия сорбции субстрата на ферменте как источник ускорения химической реакции. Профили "свободная энергия - координата рсацни". Оценка масштабов исличипы свободной энергии сближения реагентов. Сравнение, скорости и свободной энергии ферментативной и неферментативной реакции, модель "ключ-замок". Специфическое, продуктивное и непродуктивное связывание субстрата и фермента. Механизм сближения и ориентации в ферментативном катализе. Теории напряжения (или деформации) и индуцированного соответствия (Коштланд).

Химические механизмы ферментативных реакций. Стабилизация переходного состояния общим кислотно-основным катализом. Примеры кислотно-основного катализа различными функциональными группами в белках (карбоксильная группа, аминогруппа, амидная группа, имидазол, гидроксильная группа), механизмы эстафетной передачи заряда и "push-pall". Промежуточные ковалентные соединения в ферментативном катализе. Эффекты микросреды активного центра. Влияние растворителя на реакции нуклеофильного замещения, внутренняя реакционная способность функциональных групп в белках.

Роль ионов металлов в ферментативном катализе. Взаимосвязь координационного .числа и геометрии комплекса, примеры комплексов металлов с различной геометрией в биологаческих системах. Устойчивость комплексов, влияние на нее заряда и размера иона, "жесткости" и "мягкости" центрального атома и лиганда, основности лиганда, хелатного и макроциклического эффектов. Комплексообразование ионов металлов с белками. Механизмы взаимодействия фермента, иона металла и лиганда. Химические механизмы участия ионов металлов в фрментативном катализе. Окислительно-восстановительные реакции с участием ионов металлов и их роль в биологических процессах.

Коферменты. Окислительно-восстановительные коферменты: NAD, FAD, кобаламины и кобаламиды (витамин b]), аскорбиновая кислота, ферридоксин (структура и механизм действия). Коферменты, не обладающие окислительно-восстановительными свойствами: тиаминпирофосфат, пиридоксальфосфат, тетрагидрофолиевая кислота, биотип, кофермент А (структура и механизм действия).

 

 

<СТРУКТУРА АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ И МЕХАНИЗМЫ> 

ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ>

Профессор Н.Л. Клячко, 5 курс, 9й семестр

1. Классы ферментов. Номер фермента. Примеры катализируемых ферментами реакций.

2. Основные функциональные группы активных центров ферментов. Примеры.

3. Связывание субстрата в активном центре фермента. Основные группы активного центра, участвующие в связывании. Основные типы и примеры взаимодействий фермента и субстрата.

4. Кофакторы, коферменты и простетические группы ферментов. Примеры.

5. Роль ионов металлов в катализе. Примеры.

6. Гидролазы. Особенности структуры активного центра и механизм действия а-химотрипсина.

7. Гидролазы. Особенности строения активных центров, сходные черты и различия в катализе α-химотрипсином, трипсином, эластазой.

8. αХимотрипсин. Особенности взаимодействий в фермент-субстратном комплексе и переходном состоянии.

9. Клеточная стенка бактерий и гликозидазы. Лизоцим, группы активного центра, особенности механизма действия.

10. Кислые протеазына примере пепсина: особенности строения активного центра и механизма действия.

11. Тиоловые протеазы на примере папаина: особенности строения активного центра и механизма действия.

12. Особенности строения активного центра карбоксипептидазы А,

альтернативные механизмы действия фермента.

13. Рибонуклеаза: основные группы активного центра, типы катализа.

14. Специфичность ферментов: групповая, абсолютная, стереоспецифичность. Примеры.

15. Гем-содержащие белки и ферменты. Особенности строения. Основные окислительные состояния железа гема.

16. Гем-содержащие белки и ферменты. Гемоглобин и миоглобин, особенности строения и функции.

17. Гем-содержащие ферменты на примере пероксидаз: особенности структуры, механизм расщепления пероксида водорода в активном центре.

18. Ионы металлов в катализе. Карбоангидраза: особенности строения , активного центра (рН-зависимость и рК групп, участвующих в катализе), механизм действия.

19. NAD+-зависимые ферменты, особенности строения кофермента, перенос гидрид-иона. Пример катализируемой ферментом реакции с участием NAD+' (NADH).

20. Структура активного центра и механизм действия алкогольдегидрогеназы.

21. Особенности взаимодействия с субстратом и механизм действия лактатдегидрогеназы.

22. Флавопротеины. Особенности строения FMN и FAD, участие в катализе глутатионредуктазой.

23. Тиаминпирофосфат: особенности строения, участие в катализе на примере пируватдекарбоксилазы.

24. Пиридоксальфосфат: особенности строения, участие в катализе на примере рацемазы аминокислот.

25. Пиридоксальфосфат: особенности строения, образование и роль основания Шиффа (На примере реакции, катализируемой аминотрансферазой).

 

 

<ОБЩАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА>

Доцент Н.Г.Белогурова, 5 курс, 9й семестр

 

1.Место микроорганизмов в природе (животные, растения. протисты). Общие свойства микроорганизмов, (размеры, особенности метаболизма, высокая скорость размножения и т.д.).

2.Строение прокариотической клетки (отличия от эукариотической).

1)Плазматическая мембрана, клеточная стенка, ядерный аппарат, рибосомы, фотосинтетические ламеллы, включения.

2)0сновные морфологические группы бактерий.

3.Клеточная стенка грамположительных и грамотрицательных бактерий. Строение муреинового слоя. Механизм действия лизоцима и пенициллина. Протопласты и сферопласты.

4.Питание и рост микроорганизмов.

1) Потребность в химических элементах (макро- и микроэлементы).

2)Источники углерода и энергии (автотрофные и гетеротрофные микроорганизмы). Факторы роста (понятие ауксотрофии).

3) Отношение к кислороду (облигатные, акультативные аэробы, анаэробы). Аэрация (способы увеличения поверхности раздела между газовой и жидкой фазами). Анаэробные культуры. Техника Хангейта.

5.Питание и рост микроорганизмов.

1)Питательные среды (синтетические, сложные, твердые и т.д.).

2)Отношение к концентрации ионов водорода.

3 Отношение к температуре (мезофильные, термофильные и психрофильные микроорганизмы).

4)Селективные методы культивирования. Получение накопительных культур. Чистая культура. Смешанная культура.

6.Физиология роста микроорганизмов.

1)Основные понятия (концентрация и плотность бактерий, константы скорости деления и роста, время генерации и удвоения).

2)Методы определения числа бактерий (общее число клеток, число живых клеток).

3)методы определения бактериальной массы (прямые и косвенные).

4)Кинетическое описание экспоненциального роста.

7.Физиология роста микроорганизмов.

1)Рост бактерий в периодической культуре. Характеристика фаз кривой роста бактериальной культуры. Параметры кривой роста (урожай, скорость роста, длительность лаг-фазы)

2)Рост в непрерывной культуре. Характеристика роста в хемостате. Различие между периодической и непрерывной культурами.

3)Синхронизация клеточного деления.

8.Подавление роста и гибель микроорганизмов. Бактериостатическое и бактерицидное действие различных агентов. Действие на поверхностные структуры клетки (этанол, детергенты и т.д.). Дезинфекция. Ферментные яды. Механизм действия сульфониламидов,.антибиотиков (хлорамфеникол, пенициллин, стрептомицин).

Методы стерилизации. Техника безопасности при работе с микроорганизмами.

9.Основные типы брожений, вызываемые микроорганизмами. Понятие брожения как способа регенерации АТФ. Основные реакции фосфорилирования. Характерные конечные продукты различных брожений.

10.Спиртовое брожение, вызываемое дрожжами и бактериями. Общая схема. Применение дрожжей в пищевой промышленности.

11.Молочнокислое брожение. Общая схема. Основные представители (гомо- и гетероферментативное брожение). Применение и распространение молочнокислых бактерий.

12.Пропионовокислое брожение. Краткая характеристика пропионовокислых бактерий, их использование в сыроделии.

Маслянокислое и ацетоно-бутиловое брожения. Краткая характеристика бактерий родов Bacillus и Clostridium.

13.Муравьинокислое брожение. Основные роды бактериий. осуществляющие брожение по этому пути. Патогенные представители. Светящиеся бактерии.

14.Анаэробное дыхание (нитратное, сульфатное, серное, карбонатное). Соответствующие неорганические акцепторы электрона. Значение бактерий в круговороте веществ в природе.

15.Нуклеиновые кислоты: первичная и вторичная структуры. Репликация ДНК. Транскрипция. Трансляция. Способы реализации генетической информации. Генетический код.

16.Обмен генетической информацией между микроорганизмами в

природе. Трансформация. Трансдукция. Трансмиссия (конъюгация).

>

17.Модификация нуклеиновых кислотистемы рестрикции-модификации ДНК и их роль в природе. Репарация ДНК.

18.Строение генома бактерий. Хромосома. Плазмиды. их классификация (группы "несовместимости"), регуляция копийности.

19.Понятие "ген".

20.Генетическая основа эффективных экспрессирующих систем рекомбинантных белков E.сoli.

 

 

<МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ>

Профессор В.И.Тишков, 5 курс, 9й семестр

 

1. Строение ДНК. Организация и размеры генома прокариот и эукариот. Ферменты, модификации ДНК и РНК: полимеразы, обратные транскриптазы, нуклеазы и рестриктазы, лигазы, полинуклеотидкиназы. Анализ фрагментов ДНК с помощью электрофореза.

3. ДНК-зонды. Размеры, способы получения. Оптимизация структуры ДНК-зондов, получаемых на основе аминокислотной последовательности. Метки, используемые для детекции ДНК зондов. Саузерн и Нозерн-блот анализ.

2. Клонирование - генов. Получение геномных. и к-ДНК_ библиотек. Вектора, используемые для создания геномных и кДНК библиотек. Методы скриннига.

3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Принцип ПЦР. Требования к ферментам, используемым в ПЦР. Выбор праймеров и оптимизация условий ПЦР. Области применения ПЦР.

4. Секвенирование ДНК. Принципы методов химического и ферментативного секвенирования. Требования к ферментам, используемым для секвенирования. Подходы и стратегия, используемые при секвенировании по Сэнгеру. Секвенирование с помощью радиоактивных и нерадиоактивных меток.

5. Мутагенез. Направленный и неупорядоченный мутагенез. Принципы и подходы, используемые для повышения эффективности направленного мутагенеза.

6. Экспрессия рекомбинантных белков в Е.соli. Промоторы, терминаторы транскрипции. Роль рибосомсвязывающего участка в трансляции мРНК.

 

 

<МЕТОДЫ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЛКОВ>

Профессор А.К.Гладилин, 5 курс, 9й семестр

 

1. Иммобилизация белков (ферментов). Общие определения. Преимущества иммобилизованных препаратов биокатализаторов. Типы иммобилизации.

2. Носители для иммобилизации белков (ферментов). Классификация. Приемы активации носителей.

3. Физическая иммобилизация. Сравнительный анализ типов физической иммобилизации.

4. Химическая иммобилизация. Выбор групп-мишений (белка) для иммобилизации. Химические реакции, приводящие к созданию связей белок-носитель. Области применения химически иммобилизованных белков (ферментов).

5. Кинетические закономерности катализа иммобилизованными ферментами. Конформационное состояние иммобилизованного фермента. Эффекты распределения компонентов системы с иммобилизованными ферментами. Понятие о кинетическом и диффузионных режимах протекания ферментативной реакции.

6. Стабильность иммобилизованных ферментов. Обратимая денатурация и необратимая инактивация ферментов. Механизмы стабилизации ферментов иммобилизацией.

7. Фибриллярные белки. Кератин и фиброин.

8. Коллаген. Формирование коллагена. Прото- и тропо-коллаген. Элластин.

9. Миозин и актин. Структура и функции. Протеогликаны.

10. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения. Абсорбционная спектроскопия (интегральная и дифференциальная). Эмпирические правила.

11. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения. ИК- и КР-спектроскопия. Эмпирические правила.

12. Спектроскопические методы исследования белков. Общие положения. Флуоресцентная спектроскопия. Поляризация флуоресценции. Эмпирические правила.

13. Спектроскопические методы исследования белков. Дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм. Эмпирические правила.

 

 

 

 

<БЕЛКИ (ФЕРМЕНТЫ) В МЕДИЦИНЕ>>

Доктор химических наук Н.Ф.Казанская

Доктор химических наук Н.И.Ларионова

 

1. Примеры терапии нативными ферментами и их ингибиторами.

2. Модификация белковых препаратов для придания им эффективности как лекарственных средств.

3. Использование иммобилизованных белков в экстракорпоральном кровообращении.

4. Направленный транспорт белковых лекарственных веществ.

5. Включение физиологически важных белков в искусственные клетки.

 

 

<АНАЛИТИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ>

Профессор Н.Н.Угарова, 5 курс, 9й семестр

 

1. Кинетические основы ферментативных методов анализа.

Классификация 'кинетических методов  анализа. Дифференциальные методы; метод начальных скоростей, метод фиксированного времени, метод варьируемого времени. Интегральные методы. Метод конечной точки. Особенности использования индикаторных реакций первого н второго порядка. Калибровочные кривые, уравнение калибровочных кривых. метод внутреннего стандарта.

2. Использование ферментов в качестве аналитических реагентов,

Преимущества ферментов как аналитических реагентов специфичность, высокая каталитическая активность, многообразие определяемых веществ. Основные требования к современным методам анализа; правильность, низкие пределы обнаружения, экспрессность.

Методы определения субстратов и. ферментов. Активация и ингибирование., Аналитическое использование эффекта активации. Определение катализатора, активатора.  ' Различные классы ингибиторов ; .ферментов и особенности их ферментативного определения. Сопряженные полиферментные системы в анализе.

3. Основные методы индикации cкоpocmи ферментативных реакций и индикаторные соедцнения и ферменты в анализе.

Понятие об электрохимических, спектрофотометрических, флуорометрических, хемилюминесцентных, биолюминеоцентных методах детекции. Основные индикаторные продукты ферментативных систем; О2, Н2О2, NH3, НАД(Ф)Н2, АТФ, ФМН Н2 и сравнение различных методов их детекции. Основные классы ферментов, наиболее часто используемые в анализе:, оксидазы, дегидрогеназы, пероксидаэы, протеазы, люцифераы, эстеразы. Основные метаболиты и способы их ферментативного определения: аминокислоты, мочевина и ее производные, сахара, спирты, липиды.

4. Иммобилизованные ферменты в анализе.

Реакторы с иммобилизованными ферментами; колонки, трубки, реакторы с полыми нитями, мембранные реакторы. Детектирующие системы с иммобилизованными ферментами и биосенсоры. Оптоволоконные детекторы. Электроаналитические 'датчики; ферментные электроды, биочипы. Термисторы. Преимущества ферментных детектирующих сис-тем. Проблемы стабильности ферментных датчиков и правильности их работы: чувствительность; соотношение сигнал-шум, время ответа. Различные методы регистрации и обработки аналитических данных.

5. Биолюминесценция и биолюминесцентныи анализ.

Основные хеми- к биолюминесцентные системы: люциферазы светляков и бактерий, люминол-пероксидава. Аналитические возможности этих систем, их преимущества. Принципы определении АТР и использование АТР-метрии в "быстрой" микробиологии, контроле бактериаль-ных загрязнений в биологических образцах, пищевых продуктах, воде. Определение адениновых нуклеотидов. Биолюминесцентные методы определения ферментов (креатинкиназа), антибиотиков. Биолюминогенные субстрат

 

 

<. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ ОСНОВЫ ИММУНОЛОГИИ АНАЛИЗ> 

Доцент А.П.Осипов, 5 купс, 9й семестр

 

1. Основные иммунологические понятия. Свойства и функции антител. Структура и общая структурная характеристика- иммуноглобулинов, специфичность. Антиген-связывающие центры антител.

2. Физико-химические закономерности взаимодействия антиген-антитело. Методы определения аффинности антител. Равновесный диализ. Методы фракционного осаждения. Методы расчета физико-химических параметров реакции антиген- антитело.

3. Кинетические харакгерисгики взаимодейс-гвия антиген-антитело. Экспериментальные методы определения кинетических констант. Определение скоростей комплексообразоваиия с использованием меченых реагентов. Определение константы скорости ассоциации. Определение константы скорости диссоциации.

4. Ферменты как метки в иммуноанализе. Основные физико-химические и кинетические свойства ферментов. Физико-химнческие свойства ферментов, используемых в ИФА. Пероксидаза хрена. Щелочная фосфатаза. Фотометрические, флуоресцентные, хемилюминесцентные субстраты.

5. Получение антисыворотоктруктура иммуногена. Адъюванты. Выбор вида животного. Способы иммунизации. Практические процедуры иммунизации и получение антисыворотки. Тестирование антисывороток. Моноклональные антитела.

6. Методы получения конъюгатов для ИФА- Получение конъюгатов носителей с гаптенами с карбоксильной группой. Получение конъюгатов. белок-фермент. Перйодатный метод Накане. Гомобифункциональные сшивающие агенты. Получение конюъгатов с помощью глутарового альдегида, п-безохинона, малеимидный метод. Гетеробифункциональные сшивающие агенты. Получение конъюгатов с помощью активированных эфиров малеимидных соединений. Получение конъюгатов с помощью пиридилсульфидного метода. Получение конъюгатов гаптен-фермент. Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Метод смешанных ангидридов. Карбодиимидный мегод. Получение конъюгатов гаптенов с ферментами, содержащими аминогруппы. Методы с применением гомо- и гетеробифукциональных сшивающих реагентов.

7. Методы иммуноанализа. без использования меченых реагентов. Методы иммуноанализа, основанные на использовании меченых реагентов. Радиоиммунологический анализ. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) и их сравнение. ИФА с использованием меченного ферментом антигена. Конкурентный анализ. Метод двойных (вторичных) антител. Метод последовательного насыщения. Методы с использованием меченых специфических антител. Конкурентный анализ с. иммобилизованным антигеном. Сандвич-метод. Методы с использованием меченых ' антивидовых антител. Твердофазный ИФЛ с использованием нсковалентных комплексов фермента-маркера с антителами. Твердофазный анализ в проточных системах.

8. Теоретические основы ИФА. Закономерности конкурентного анализа. Закономерности сэндвич-анализа. Длительность анализа, предел обнаружения.

9. Биосенсорные устройства, основанные на различных методах детекции. Электрохимические биосенсоры. Полупроводниковые биосенсоры. Оптические квантовые системы (поверхностный плазменный резонанс, , диффракционные решетки, эффект полного отражения и т.д.) Амплификационные системы преобразования сигнала.

10. Флуоресцентный анализ. Флуоресцентный иммуноанализ с разрешением во времени, типы используемых меток, типы проведения анализа. Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ.

11. Методы представления и обработка экспериментальных данных. Калибровочные графики. Стандартное отклонение, стандартная ошибка, коэффициент вариации, доверительный интервал.